苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA)，即2-羥基-3-苯基丙酸，是一種新型的生物防腐劑，它具有抗革蘭氏陽性菌、陰性菌和真菌等功能。此外，苯基乳酸還是中藥提取物“丹參素”的類似物，具有一定的藥用價值。因此苯基乳酸的開發(fā)和利用具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，苯乳酸主要由化學(xué)合成或微生物轉(zhuǎn)化兩種方式獲得，化學(xué)合成法在不同程度上存在污染環(huán)境、技術(shù)復(fù)雜、條件苛刻、副產(chǎn)物多等缺陷。因此，研究人員將研究方向轉(zhuǎn)向了生物合成法。近幾年用于苯乳酸研究的微生物主要有白地霉、丙酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。2000年，LAVERMICOCCA P等首次報道從酸面團(tuán)中分離到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)21B，苯乳酸產(chǎn)量達(dá)到56.44mg/L。隨后研究相繼獲得多株產(chǎn)苯乳酸的乳酸菌，但菌株間產(chǎn)量差異較大，且苯乳酸產(chǎn)量相對都較低。

乳酸脫氫酶是自然界微生物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯基乳酸的關(guān)鍵酶，但由于該酶催化過程中需要消耗體系中的還原型輔酶，還原型輔酶的額外添加使反應(yīng)成本顯著增加。因此開發(fā)系統(tǒng)中還原型輔酶再生的方法亦是研究的關(guān)鍵。近年來，甲酸脫氫酶在輔酶再生中的應(yīng)用已成為輔酶酶法再生研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，甲酸脫氫酶體系是最成功的再生體系。因此，如果能在乳酸脫氫酶催化苯丙酮酸轉(zhuǎn)化生成苯基乳酸的同時，結(jié)合甲酸脫氫酶應(yīng)用于輔酶NADH的酶耦聯(lián)法再生系統(tǒng)，可能能夠大幅度提高苯乳酸產(chǎn)量。

本發(fā)明的目的是：

（1）提供一種增強(qiáng)D-苯基乳酸產(chǎn)量的D-LDH-FDH融合基因的cDNA序列。

（2）提供上述cDNA序列的構(gòu)建方法。

（3）提供包含上述cDNA序列的載體。

（4）提供包含載體的宿主細(xì)胞。

（5）提供上述cDNA序列的表達(dá)方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一、一種增強(qiáng)D-苯基乳酸產(chǎn)量的D-LDH-FDH融合基因的cDNA序列，由D-LDH基因、連接肽的DNA序列和FDH基因串聯(lián)而成，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，編碼SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及經(jīng)過取代、缺失或者疊加一個或幾個氨基酸衍生的蛋白質(zhì)。

二、上述的cDNA序列的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟：

(1)設(shè)計PCR引物，使D-LDH的下游引物和FDH的上游引物具有一段重疊互補(bǔ)區(qū)域；

(2)分別通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增兩個基因；

(3)利用overlap extension PCR技術(shù)，將兩個基因片段拼接起來，同時在兩個基因之間添加柔性的連接肽序列。 

三、一種載體，包含上述的cDNA序列。

四、一種宿主細(xì)胞，含有上述的載體。

五、一種上述的cDNA序列的表達(dá)方法，包括用上述的載體，轉(zhuǎn)化上述的宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)得融合蛋白。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明將乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶通過連接肽串聯(lián)得到融合蛋白，該蛋白在大腸桿菌中表達(dá)后，保持了兩種酶的活性，使兩種酶在空間上更加靠近，功能輔助上更加便利，并且融合蛋白中的乳酸脫氫酶的酶活性較單獨(dú)表達(dá)時高，較乳酸脫氫酶，甲酸脫氫酶在同一細(xì)胞內(nèi)分開表達(dá)時高。催化苯丙酮酸轉(zhuǎn)化成苯基乳酸時表現(xiàn)出更強(qiáng)的催化效果；融合基因構(gòu)建方法簡單、易操作；采用的連接肽利于兩個基因所編碼的蛋白質(zhì)保持原來的構(gòu)象，不影響蛋白的活性；本發(fā)明對于苯乳酸的生產(chǎn)具有非常重要的意義。