DNA折紙術(shù)(DNA origami)是DNA納米自組裝的一種主流方法,通常一條DNA主鏈在成百上千條合成的DNA短鏈輔助下,通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則折疊并鎖定生成所設(shè)計(jì)的納米結(jié)構(gòu)。而單鏈DNA折紙(single?stranded DNA origami,ssDNA origami)是傳統(tǒng)DNA折紙術(shù)的一種進(jìn)化和衍生，它摒除了傳統(tǒng)折紙術(shù)對(duì)眾多短序列的需求，通過(guò)高度集成序列信息于一條長(zhǎng)單鏈DNA中,實(shí)現(xiàn)了由一條DNA序列自組裝成復(fù)雜可控的納米結(jié)構(gòu)。與多鏈DNA折紙術(shù)相比，單鏈DNA折紙術(shù)避免了多條DNA折紙術(shù)形成過(guò)程中可能形成的缺陷和錯(cuò)誤，提高了整個(gè)納米結(jié)構(gòu)的局部尋址能力和分辨率，同時(shí)由于形成完整的單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)中沒(méi)有缺口，因此，比多鏈DNA納米結(jié)構(gòu)(msDNs)在生物條件下更加穩(wěn)定。

脂質(zhì)體是一類(lèi)經(jīng)過(guò)充分研究的用于藥物遞送的納米顆粒。由于DNA納米結(jié)構(gòu)在某些癌細(xì)胞中具有增強(qiáng)的細(xì)胞傳遞性能，因此具有成為下一代分子傳遞媒介的潛力。傳統(tǒng)的控制脂質(zhì)體大小的經(jīng)典方法取決于脂質(zhì)體形成條件(例如脂質(zhì)組成和溶劑與水的混合比)以及形成后的均質(zhì)化(例如擠壓和超聲處理)和純化(例如離心和體積排阻色譜)。生產(chǎn)結(jié)果與憑經(jīng)驗(yàn)確定的參數(shù)有關(guān)，因此限制了用戶(hù)選擇性改變脂質(zhì)體大小和組成的能力。基于微流體的系統(tǒng)提供了調(diào)節(jié)脂質(zhì)體大小和分散性，但通常需要內(nèi)部使用非標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備。

自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)已經(jīng)以多種非常規(guī)方式與脂質(zhì)雙層相接，以實(shí)現(xiàn)可編程膜工程的目標(biāo)。第一種方法是使用DNA模板形成脂質(zhì)體支架，精度極高，但任何現(xiàn)有膜都需要在重新組裝之前進(jìn)行膠束化處理。第二種策略是通過(guò)按需寡聚或重新配置的DNA裝置重塑脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)，這可能會(huì)保留某些先前存在的膜特征(例如脂質(zhì)組成，內(nèi)部含量)，但最終產(chǎn)物往往不太均勻。

為了克服上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用ssDNs輔助的脂質(zhì)體分選技術(shù)可以輕松生成具有不同大小的脂質(zhì)體，這種復(fù)合物在生物狀態(tài)下具有更好的穩(wěn)定性，并且比裸脂質(zhì)體在幾種癌細(xì)胞有更好的攝取。我們的ssDNs輔助分選技術(shù)(與ssDNs的形狀無(wú)關(guān))容易產(chǎn)生平均直徑約為40?140nm的脂質(zhì)體，從而為系統(tǒng)探索ssDNs包覆的脂質(zhì)體被活細(xì)胞吸收有關(guān)的大小和形狀提供了一個(gè)有吸引力的平臺(tái)。

一方面，本發(fā)明提供了一種利用單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)輔助分選脂質(zhì)體的方法，所述方法包括以下步驟：

步驟S1：制備單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)；

步驟S2：將所述步驟S1制備的單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)與待分選的脂質(zhì)體混合、孵育，得到單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)包裹的脂質(zhì)體復(fù)合體溶液；

步驟S3：將所述步驟S2中得到的脂質(zhì)體復(fù)合體溶液等密度梯度離心，得分層液；

步驟S4：分別自上而下收集分層液。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種脂質(zhì)體復(fù)合體，所述脂質(zhì)體表面連接有單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

1、本發(fā)明提供了一種高效制備單鏈DNA結(jié)構(gòu)的方法，利用輔助噬菌體法獲得含有單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)序列的單鏈?zhǔn)删?，并在長(zhǎng)單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)基因序列的5'和3'端分別添加依賴(lài)Zn 的I類(lèi)DNA切割脫氧核酶識(shí)別序列，通過(guò)這種生物方法富集的單鏈?zhǔn)删w在DNA脫氧核酶的酶切作用下以低成本、高產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)獲得單鏈DNA納米序列，同時(shí)，獲得的單鏈DNA序列在適當(dāng)?shù)捏w系中自組裝成最終的單鏈三角形結(jié)構(gòu)，不需要純化，直接進(jìn)行下一步脂質(zhì)體的分選。而多條鏈組裝形成的納米結(jié)構(gòu)(三點(diǎn)星狀結(jié)構(gòu)以及六螺旋束)，組裝所使用的DNA鏈一般通過(guò)化學(xué)合成，成本高，產(chǎn)率低，并且組裝后的結(jié)構(gòu)純化較麻煩，并且純化過(guò)程會(huì)進(jìn)一步損失結(jié)構(gòu)的最終產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，獲得的單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)(ssDNs)比多鏈DNA納米結(jié)構(gòu)(msDNs)更能抵抗核酸外切酶的降解，具有更好的穩(wěn)定性。

2、利用本發(fā)明的單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)包被的脂質(zhì)體，與裸脂質(zhì)體相比顯著提高了其在癌細(xì)胞的攝取率，同時(shí)，本發(fā)明改進(jìn)了利用DNA結(jié)構(gòu)分選liposome的工藝，本發(fā)明中ssDNs輔助分選技術(shù)容易產(chǎn)生平均直徑約為40?140nm的脂質(zhì)體，從而為系統(tǒng)探索與ssDNs包覆的脂質(zhì)體被活細(xì)胞吸收有關(guān)的大小和形狀提供了一個(gè)有吸引力的平臺(tái)，為大規(guī)模制備DNA?liposome奠定了基礎(chǔ)。

3、本發(fā)明在三種不同的細(xì)胞系中檢測(cè)了三種不同大小的脂質(zhì)體(520?nt三角形包被)的細(xì)胞攝取情況，其平均直徑分別為40nm，72nm和96nm。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了單鏈三角形涂層在HeLa和MDA?MB?231細(xì)胞中增加脂質(zhì)體的吸收中起著重要作用。同時(shí)在兩種癌細(xì)胞(HeLa和MDA?MB?231)中，三角形包裹的脂質(zhì)體比較容易攝入，并且脂質(zhì)體大小與有效攝取之間呈正相關(guān)，而在HEK 293T細(xì)胞中三種不同大小的脂質(zhì)體均表現(xiàn)出弱的攝取。本發(fā)明中脫氧核酶催化有效生產(chǎn)ssDNs和ssDNs輔助分選脂質(zhì)體的策略使我們能輕松研究ssDNs包被的脂質(zhì)體的攝取在所有癌細(xì)胞系與正常細(xì)胞系中是否有區(qū)別，每種癌細(xì)胞系是否都具有唯一的最佳脂質(zhì)體大小，內(nèi)在的ssDNs包被的脂質(zhì)體的細(xì)胞命運(yùn)如何以及包裹在脂質(zhì)體上的ssDNs的形狀和表面積對(duì)質(zhì)量的比率如何影響攝取等問(wèn)題。