藍(lán)豬耳(Torenia fournieri)又名夏堇，屬雙子葉植物門，合瓣花亞綱，玄參科藍(lán)豬耳屬。被子植物的胚囊大多數(shù)都是緊密包裹在胚珠珠心組織里，生殖過程的受精機(jī)理及代謝活動(dòng)需借助經(jīng)典結(jié)構(gòu)植物學(xué)研究技術(shù)如半薄、超薄切片及組織透明法等，才能做進(jìn)一步研究。若動(dòng)態(tài)的觀察被子植物受精過程中卵細(xì)胞的變化狀態(tài)，藍(lán)豬耳更為適合。藍(lán)豬耳雌配子成熟的過程中，胚囊會(huì)從珠孔端伸出珠被組織之外。待卵器完全成熟，在光學(xué)顯微鏡下清晰可見。這種特殊的半裸露胚囊結(jié)構(gòu)，為研究被子植物生殖生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)提供了很好的研究材料，對(duì)高等植物雙受精機(jī)理和早期胚胎發(fā)育的研究具有重要的意義。

完整的植物組織培養(yǎng)系統(tǒng)與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)組成了轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建的一般系統(tǒng)。藍(lán)豬耳莖段和葉片在不同濃度的生長(zhǎng)激素相配合的作用下可以誘導(dǎo)出根、芽和愈傷組織等植物器官：1/2MS、6?BA、NAA相結(jié)合可以誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生，而MS、6?BA、2,4?D配合可誘導(dǎo)愈傷組織，生根培養(yǎng)基為1/2MS；同時(shí)花芽和胚也可以作為藍(lán)豬耳組織培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)出植物組織。Aida在1996年就對(duì)藍(lán)豬耳分子育種進(jìn)行了相關(guān)研究，初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的藍(lán)豬耳遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。Fukusaki成功誘導(dǎo)出白色和淺色花瓣的轉(zhuǎn)基因株系。在藍(lán)豬耳遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，常以葉片作為外植體，且共培養(yǎng)階段比較重要，其中菌液浸染植物材料的時(shí)間以10～20min為宜，共培養(yǎng)7天轉(zhuǎn)化率達(dá)27％以上。李梅蘭認(rèn)為在共培養(yǎng)階段暗培養(yǎng)4天效果最佳，且與誘導(dǎo)愈傷再生體系相比，誘芽時(shí)間較短，轉(zhuǎn)化效率相同；龍海濤等人利用愈傷誘導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)藍(lán)豬耳進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，該方法轉(zhuǎn)化率達(dá)13％～14％。浸染過程是轉(zhuǎn)化過程中重要的步驟，浸染效率直接關(guān)系到后期材料的轉(zhuǎn)化率。

 本發(fā)明在已有研究的基礎(chǔ)上對(duì)浸染條件及后續(xù)流程進(jìn)行了優(yōu)化，首次在藍(lán)豬耳轉(zhuǎn)化的過程中加入了Silwet L?77，使農(nóng)桿菌的浸染效率得到了顯著提高；并且添加了頭孢清洗步驟來去除農(nóng)桿菌污染，固體培養(yǎng)基上降低了頭孢濃度，減少了對(duì)抗性芽生長(zhǎng)的抑制。通過定位于卵細(xì)胞的特異性啟動(dòng)子DD45(DD45是一種特異性表達(dá)于卵細(xì)胞的啟動(dòng)子，在單子葉植物水稻與雙子葉植物擬南芥體內(nèi)均可表達(dá))，構(gòu)建載體DD45：MT?GFP，對(duì)藍(lán)豬耳卵細(xì)胞線粒體進(jìn)行特異性標(biāo)記，結(jié)果表明，本發(fā)明的藍(lán)豬耳遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率高，且可以穩(wěn)定遺傳。

本發(fā)明的目的是按以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種藍(lán)豬耳遺傳轉(zhuǎn)化方法所述方法包括：

(1)共培養(yǎng)階段：將藍(lán)豬耳無菌苗葉片剪成邊長(zhǎng)小于1cm的小片后，放入到OD600＝0.7的菌液中5min；所述菌液中含有0.01vol％Silwet L?77、20μmol/LAS；然后將葉片轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中23～25℃避光培養(yǎng)4～7天；共培養(yǎng)階段所用的固體培養(yǎng)基成分是：MS；6?BA1.0mg/L；2,4?D 0.1mg/L；AS 200μmol/L；

(2)愈傷誘導(dǎo)階段：將步驟1共培養(yǎng)之后的材料轉(zhuǎn)移至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培養(yǎng)，培養(yǎng)三周；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基基成分是：MS6?BA1.0mg/L；2,4?D 0.1mg/L；Kan200mg/L；Cef 300mg/L；

(3)芽誘導(dǎo)階段：將步驟2獲得的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培養(yǎng)7天，誘導(dǎo)出抗性芽，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分是：1/2MS；6?BA1.0mg/L；IAA0.1mg/L；Cef 300mg/L；

(4)抗性芽篩選階段：將步驟3培養(yǎng)后的材料轉(zhuǎn)移至篩選抗性芽培養(yǎng)基上，23～25℃、8h黑暗16h光照培養(yǎng)三周，得到2～3cm高的墨綠色小苗；抗性芽培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分是：MS；6?BA1.0mg/L；IAA 0.1mg/L；Kan 200mg/L；Cef 300mg/L。

(5)生根階段培養(yǎng)：將步驟4的墨綠色小苗剪下，扦插至生根培養(yǎng)基，待小苗長(zhǎng)至4?6cm即可煉苗，移栽至花盆，生根培養(yǎng)基成分是：1/2MS；IAA0.4mg/L；Kan 50mg/L。

1、藍(lán)豬耳是發(fā)育生物學(xué)模式植物，其半裸露的胚囊極大的降低了對(duì)被子生物生殖生物學(xué)的研究難度，而此優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的建立，大大的縮短了藍(lán)豬耳的研究難度，為被子植物雙受精的研究奠定了基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)方法中加入了表面活性劑增強(qiáng)了農(nóng)桿菌的浸染效率，從而藍(lán)豬耳遺傳轉(zhuǎn)化率也得到了提高。

3、本發(fā)明加入除菌環(huán)節(jié)，有效的預(yù)防了農(nóng)桿菌過渡生長(zhǎng)帶來的材料污染。

4、本發(fā)明首先利用低濃度的抗生素對(duì)葉片進(jìn)行抗性愈傷組織的誘導(dǎo)，隨后利用物抗培養(yǎng)基讓抗性愈傷組織充分分化，產(chǎn)生不定芽，隨后又利用高濃度的抗生素篩選抗性芽，此過程完整進(jìn)行使農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了高陽性率的轉(zhuǎn)基因株系。